全自動(dòng)樣品研磨儀提取小鼠尾巴RNA的實(shí)驗(yàn)步驟
實(shí)驗(yàn)步驟
1、首先將上海凈信的組織研磨機(jī)上的制冷模塊預(yù)先置于-20℃,使用時(shí)取出安裝好。將研磨珠去RNA酶處理。
2、隨機(jī)抽取小鼠的尾巴100µg,把樣本剪成盡可能小段,置于無(wú)RNA酶的2研磨單位離心管中(選擇耐液氮冷凍管子),同時(shí)加入1顆5號(hào)研磨珠和2顆3號(hào)研磨珠(如果選擇1.5研磨單位離心管,只需要加入4-5顆3號(hào)研磨珠)。
3、放置于液氮中一起浸泡3分鐘,取出放置于預(yù)冷模塊中,在全自動(dòng)樣品研磨儀上選擇13單位頻振研磨60s。(該步驟可以根據(jù)研磨的細(xì)微程度要求可以再重復(fù)一遍)
4、把研磨好的樣本加入0.06ml的PBS0.14ml的RNAiso Plus(此處選擇PBS,可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要加入其他提取液,如1ml TRIzol等),繼續(xù)置于研磨機(jī)上選擇13單位頻振研磨60s。樣本將處于糊狀。(其他提取試劑有可能會(huì)出現(xiàn)泡沫,不影響實(shí)驗(yàn))
5、取出研磨管,放入冷凍離心機(jī)中,于4度,12000g離心10分鐘
6、小心吸取上清液0.1ml至新的1.5研磨單位離心管中,蓋上管蓋,在室溫上孵育15分種,使樣品充分裂解至勻漿液較透明,如果仍有少量顆粒屬于正常情況,不影響RNA提取質(zhì)量和得率。
7、在1.5研磨單位離心管中加入0.02ml氯仿,蓋緊管蓋,振蕩混勻并將其在冰上孵育15分種,于4度,12000g離心15分鐘。離心后混合物分層:上清層,中間層,下層;RNA存在于上清層中。
8、將上清層小心轉(zhuǎn)移到一干凈的離心管中,加入等體積冰浴的異丙醇,顛倒振蕩混勻,將混合的樣品在-20度條件,孵育20分種,于4度,12000g離心10分鐘。RNA沉淀通常形成片狀沉淀附著于管壁或管底。
小心棄去上清,用1ML的冰浴75%的乙醇洗滌RNA沉淀一次,顛倒洗滌離心管管壁,并旋渦振蕩樣品,盡可能讓沉懸浮,于4度,12000g離心5分鐘,再次去除上清,晾干沉淀。
10、操作的后,在陰涼處適度干燥RNA沉淀(避免過(guò)分干燥,那樣會(huì)降底它的可溶性)。
11、用適量(一般可用0.01—0.02ml)的無(wú)RNA酶水或TE溶液來(lái)溶解RNA。抽提好的RNA,保存于-70度。
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